Aeskulap-Stab
Einleitung
Luminanz-Kontrast
Relief-
Phasenkontrast
Abgeblendeter 
Phasenkontrast
Abgeblendetes 
Dunkelfeld
Digitaler
Phasenkontrast
Mikrofotografie
und Analyse
Zytometrie im
Reflexionskontrast
Kapillaroskopie
Video-Endoskopie
Kardiovaskuläre
Risikokalkulation
Verhaltensbezogenes 
Risiko-Management
Effizienz der
Rehabilitation
Diagnostik in der
Rehabilitation
Komplementäre
Medizin
Publikationen
Lebenslauf
Universität
Oradea
U.N.E. Brüssel
Abgeblendeter Phasenkontrast

Konventioneller Phasenkontrast ist technisch so ausgelegt, dass die Aperturblende des Kondensors, sofern vorhanden, voll geöffnet bleiben muss, wenn Phasenkontrast-Beleuchtung angewendet werden soll. Würde die Aperturblende während einer üblichen Phasenkontrast-Beobachtung geschlossen, hätte dies eine sofortige Bildabdunkelung zur Folge, da der schmale ringförmige Lichtdurchlass im Inneren des Kondensors von der in nahezu gleicher Ebene befindlichen Aperturblende überdeckt würde. Hieraus folgt, dass bei konventioneller Phasenkontrast-Beleuchtung keine Steigerung von Tiefenschärfe, Konturschärfe und Kontrast durch Abblenden des Kondensors erreicht werden kann. Diese Einschränkung kann beispielsweise von Nachteil sein, wenn Objekte mit relativ hoher Raumtiefe oder extrem geringer optischer Dichte im Phasenkontrast beobachtet oder fotografiert werden sollen.

Typischerweise zeigen Phasenkontrastbilder im Randbereich von Strukturen mehr oder weniger deutlich erkennbare Lichtsäume (Halo-Phänomene), welche als Nachteil dieser Methode zu betrachten sind. Die Intensität dieser Halo-Artefakte ist abhängig von der Schichtdicke des Objektes und den optischen Dichteunterschieden zwischen Objekt und Medium; sie kann bei konventionellen Phasenkontrastbeobachtungen vom Untersucher nicht beeinflusst werden.

Der Bildkontrast wird bei konventioneller Phasenkontrastbeleuchtung ausschließlich von der technischen Auslegung des Phasenringes, der Güte der verwendeten Optik und dem Gangunterschied zwischen Objekt und umgebendem Medium bestimmt. Bei typischen biologischen Phasenobjekten wird das Licht im Mittel um eine Viertelwellenlänge phasenverzögert. Konventionelle Phasenkontrast-Techniken sind so ausgelegt, dass bei einem solchen Gangunterschied ein optimaler Kontrast entsteht. Hieraus ergibt sich, dass der Kontrast feiner Objektstrukturen suboptimal werden kann, wenn der tatsächliche Gangunterschied von diesem Durchschnittswert abweicht.

Um die vorerwähnten Einschränkungen des Phasenkontrastverfahrens zu überwinden, wurde vom Autor ein neuartiges Phasenkontrast-Mikroskop als Prototyp entwickelt, welches die Möglichkeit bietet, auch bei Phasenkontrast-Untersuchungen die kondensorseitige Aperturblende in ähnlicher Weise zur Steigerung der Bildqualität einzusetzen, wie dies bei anderen Untersuchungen im durchfallenden Licht geläufig ist. Hieraus ergeben sich für die praktische Beobachtung mehrere Vorteile:

- Steigerung der Konturschärfe, vor allem bei linearen Strukturen
- Anhebung des Objektkontrastes
- Steigerung der sichtbaren Tiefenschärfe
- Verringerung von Randunschärfen infolge sphaerischer Aberration.
- Abschwächung oder Beseitigung von Halo-Artefakten
- Erhöhte Plastizität bei Schrägbeleuchtung

 

Prinzip des abgeblendeten Phasenkontrastes

Im konventionellen Phasenkontrast befindet sich der Phasenring in der hinteren Brennebene des Objektivs. Der hierzu passende ringförmige Lichtdurchlass ist im Kondensor so angeordnet, dass er mit dem Phasenring optisch kongruent ist und in der hinteren Brennebene des Objektivs scharf abgebildet wird. Die Aperturblende des Kondensors projiziert sich ebenfalls in die hintere Objektivbrennebene. Hieraus folgt, dass bei dieser Anordnung die Aperturblende nicht verengt werden kann, da sie sich in die selbe Ebene projiziert, wie der ringförmige Lichtdurchlass des Kondensors; folglch würde der Lichtdurchtritt von der verengten Aperturblende verlegt.

Wenn die Aperturblende des Kondensors zur Abblendung eines Phasenkontrastbildes effektiv eingesetzt werden soll, muss der Phasenkontrast-Kondensor in seinem optischen Design so verändert werden, dass sich die Aperturblende nicht mehr in die hintere Objektivbrennebene projiziert, sondern in eine Intermediär-Ebene, welche zwischen der hinteren Objektivbrennebene und der Objektebe angeordnet ist. Durch eigene praktische Tests konnte ermittelt werden, dass die Projektionsebene der Aperturblende zweckmäßigerweise im Strahlengang etwa 5 – 10 mm tiefer, d. h. näher zum Objekt hin verlagert wird. In umgekehrter Weise könnte abgeblendeter Phasenkontrast auch realisiert werden, wenn der Phasenring in hinreichender Distanz aus der hinteren Objektivbrennebene verlagert würde; bei dieser Ausführungsvariante könnte die Projektionsebene der Aperturblende wie üblich in der hinteren Brennebene des Objektivs verbleiben. Entscheidend ist somit letztlich, dass die optische Projektionsebene der Aperturblende in hinreichender Distanz von der realen Ebene des Phasenringes bzw. der Projektionsebene des korrespondierenden Kondensorlichtringes abweicht.

Die durch Abblenden der Aperturblende erreichbaren qualitätsverbessernden optischen Effekte können nach bisherigen experimentellen Ergebnissen noch weitergehend gesteigert werden, wenn eine zweite Irisblende unterhalb der Aperturblende in den beleuchtenden Strahlengang eingefügt wird (zweistufige Abblendung). Sofern diese zweite Irisblende dezentriert wird, kann ein schräger Lichteinfall der beleuchtenden Strahlenbündel realisiert werden, so dass der räumliche Charakter des Phasenkontrast-Bildes weitergehend betont wird. Die hierdurch erhältlichen Effekte sind dem vorbeschriebenen Relief-Phasenkontrast in etwa vergleichbar. Zusätzlich kann bei geeigneten Objekten die laterale Auflösung durch Schrägbeleuchtung sichtbar gesteigert werden. Die abbildenden und beleuchtenden Strahlengänge mit ihren zugehörigen konjungierten Ebenen und deren vorbeschriebene Verschiebungen werden in Abb. 1 veranschaulicht.

 

abgeblendeter Phasenkontrast Strahlengang kleiner

Abb. 1: Beleuchtender und abbildender Strahlengang im zusammengesetzten Lichtmikroskop (modifiziert nach Linkenheld), Verschiebung der Projektionsebenen im abgeblendeten Phasenkontrast

 1 = Lichtquelle
 2 = Kollektor
 3 = Leuchtfeldblende
 4 = Aperturblende
 5 = Kondensor
 6 = Objekt (grüner Pfeil)
 7 = Objektiv
 8 = hintere Objektivbrennebene
 9 = Zwischenbild
10 = Okular
11 = hintere OKularbrennebene
12 = Auge

 

 

Die Projektionsebene A der Aperturblende (4) wird bei abgeblendetem Phasenkontrast in die tiefer gelegene Ebene A´ verschoben. Die Leuchtfeldblende (3) wird nicht mehr in die Objektebene B projiziert, sondern in eine tiefer gelegene Ebene B´.
Eine zusätzliche Irisblende kann unterhalb der Aperturblende (4) in Ebene 3´ positioniert werden, um eine zweistufige Abblendung und bedarfsweise Schrägbeleuchtung zu realisieren. Bei geeigneter Vertikalverschiebung kann diese Zusatzblende im abgeblendeten Phasenkontrast auch als leuchtfeldblende fungieren, wenn sie so in ihrer Höhe positioniert wird, dass sie sich in die Objektebene (6) projiziert.

Bei dem entwickelten Prototyp wurde ein Universalkondensor zur Hellfeld-, Phasenkontrast- und Dunkelfelduntersuchung (Konstruktionstyp nach Zernike) optisch in der erforderlichen Weise modifiziert, so dass die notwendige Verlagerung der Aperturblenden-Projektionsebene erreicht wurde. Gleichzeitig wurde eine variable Einstellung der Schnittweite des Kondensors realisiert, so dass die beleuchtenden Strahlen in veränderbarem, unterschiedlich steilem Winkel auf das Objekt treffen konnten. Schließlich wurde direkt unterhalb der Aperturblende im Kondensor eine zweite Irisblende integriert, welche horizontal verschoben werden konnte. Wurde diese Zusatzblende in zentrierter Position geschlossen, ergab sich eine noch weitreichendere Steigerung der die resultierende Tiefenschärfe infolge zweistufiger Abblendung. Durch kontrollierte Dezentrierung dieser zweiten Blende konnte eine Schrägbeleuchtung erreicht werden.

Durch diese Veränderungen des optischen Designs erschließt sich die Möglichkeit, die Aperturblende des Kondensors nun auch bei Phasenkontrast-Beobachtungen zur Verbesserung der Bildqualität einzusetzen. Wenn nur die Aperturblende verengt wird und die Zusatzblende voll geöffnet bleibt, ergibt sich eine konzentrische, einstufig abgeblendete Beleuchtung. Tiefenschärfe und Kontrast können noch weitergehend gesteigert werden, wenn zusätzlich die zweite Irisblende hinreichend geschlossen wird (zweistufige Abblendung). Solange die Zusatzblende zentriert angeordnet bleibt, besteht weiterhin ein konzentrische Objektausleuchtung aus allen Raumrichtungen. Durch Dezentrieren der verengten Zusatzblende kann ein Übergang in eine stufenlos variierbare Schrägbeleuchtung erreicht werden.

Insbesondere die zweistufige Abblendung führt zu einer deutlich erhöhten Plastizität und Betonung der räumlichen Objektstruktur, welche mit Interferenzkontrast vergleichbar ist und diesen in manchen Beobachtungssituationen sogar noch übertrifft. Im Unterschied zum Interferenzkontrast werden ausschließlich real vorhandene dreidimensionale Strukturen wiedergegeben, während im Interferenzkontrast auch Pseudo-Relief-Effekte entstehen können, wenn sich der regionäre Brechungsindex innerhalb eines Objektes ändert. Beispiele für die vorerwähnten Einstellungen werden in Abb. 2 und 3 gezeigt. 

Die verschiedenen Ausführungsvarianten, welche zur Realisierung dieser Beleuchtungsverfahren in Betracht kommen, wurden zum Patent angemeldet.

 

abgeblendeter Phasenkontrast, Alaun kleiner

Abb. 2: Alaunkristalle, präpariert ohne Deckglas, Schicktdicke: 0,018 mm
horizontale Feldweite: 0,4 mm, Objektiv 10x, Okular 10x,
links: Konventioneller Phasenkontrast
Mitte: Einstufig abgeblendeter Phasenkontrast)
rechts: Zweistufig abgeblendeter Phasenkontrast, dezente Schrägbeleuchtung


abgeblendeter Phasenkontrast, Blut kleiner

Abb. 3: Leukämie, Ausstrichpräparat unter Deckglas, Schichtdicke: 0,007 mm
horizontale Feldweite 0,12 mm (links) bzw. 0,06 mm (rechts), Objektiv 32x, Okular 10x
zweistufig abgeblendeter Phasenkontrast, moderate Schrägbeleuchtung

 

Bisherige Publikationen:

Piper, J.: Abgeblendeter Phasenkontrast – Eine attraktive optische Variante zur Verbesserung von Phasenkontrastbeobachtungen
(eingereicht: 05.01.2009, angenommen: 21.01.2009)
Mikrokosmos 98, Heft 4, 249-254, 2009

Piper, J.: Condenser aperture reduction phase contrast – a new technique for improved imaging in light microscopy
(eingereicht: 24.03.2010, angenommen: 09.04.2010)
Journal of Advanced Microscopy Research (JAMR)

Copyright: Joerg Piper, Bad Bertrich, Germany, 2010

 

[Einleitung]
[Luminanz-Kontrast]
[Relief-Phasenkontrast]
[Abgeblendeter Phasenkontrast]
[Abgeblendetes Dunkelfeld]
[Digitaler Phasenkontrast]
[Digitale Mikrofotografie und Analyse]
[Zytometrie im Reflexionskontrast]
[Kapillaroskopie]
[Video-Endoskopie]
[Mathematische Kalkulation kardiovaskulärer Risiken]
[Verhaltensbezogenes Risiko-Management]
[Effizienz der Rehabilitation]
[Diagnostik in der Rehabilitation]
[Komplementäre Medizin]
[Publikationen]
[Lebenslauf]
[Universität Oradea]
[U.N.E. Brüssel]