Aeskulap-Stab
Einleitung
Luminanz-Kontrast
Relief-
Phasenkontrast
Abgeblendeter 
Phasenkontrast
Abgeblendetes 
Dunkelfeld
Digitaler
Phasenkontrast
Mikrofotografie
und Analyse
Zytometrie im
Reflexionskontrast
Kapillaroskopie
Video-Endoskopie
Kardiovaskuläre
Risikokalkulation
Verhaltensbezogenes 
Risiko-Management
Effizienz der
Rehabilitation
Diagnostik in der
Rehabilitation
Komplementäre
Medizin
Publikationen
Lebenslauf
Universität
Oradea
U.N.E. Brüssel
Abgeblendetes Dunkelfeld

Ebenso, wie bei Phasenkontrastbeleuchtung, muss auch bei konventionellen Dunkelfeldbeobachtungen die Aperturblende des Kondensors, sofern vorhanden, voll geöffnet bleiben. Bei konventioneller Ausführung können spezielle Dunkelfeld-Objektive mit integrierter Irisblende verwendet werden, um die optischen Vorteile einer moderaten Objektiv-Abblendung zu nutzen. Hierzu ist allerdings einschränkend anzumerken, dass die Möglichkeiten einer Objektivabblendung in der Praxis begrenzt sind. Zunächst führt die Verringerung der Objektiv-Apertur, welche durch jedes Abblenden des Objektivs zustande kommt, rasch zu sichtbaren Verschlechterungen der lateralen Bildauflösung, so dass solche Objektive im praktischen Gebrauch meist nur schwach abgeblendet werden können. Zusätzlich ergibt sich durch eine Objektivabblendung in dem sinnvoll durchführbaren Umfang nur eine geringe Anhebung der effektiven Tiefenschärfe und eine mäßige Abschwächung vorhandener Überstrahlungen von randbegrenzenden Objektstrukturen.

Um diese Limitierungen der konventionellen Dunkelfeldtechnik zu überwinden, wurde in Anlehnung an den vorbeschriebenen abblendbaren Phasenkontrast eine optische Anordnung für abblendbares Dunkelfeld entwickelt, welche im Vergleich zur herkömmlichen Technik zu wesentlichen Verbesserungen der Abbildungsqualität führt.

Bei dieser Methode resultiert aus einer Abblendung des Kondensors eine sichtbare Steigerung der Tiefenschärfe, welche der mit Dunkelfeld-Objektiven erreichbaren Anhebung der Bildtiefe deutlich überlegen ist. Zusätzlich werden die üblicherweise vorhandenen Überstrahlungen an Grenzstrukturen wesentlich nachhaltiger verringert. Feine Konturen können zudem durch die Abblendung klarer hervorgehoben werden.

 

Prinzip des abgeblendeten Dunkelfelds

Um abgeblendetes Dunkelfeld zu erreichen, muss der Strahlengang so modifiziert werden, wie für abblendbaren Phasenkontrast beschrieben (siehe dort). Zu diesem Zweck wurde ein Universalkondensor zur Hellfeld-, Dunkelfeld. und Phasenkontrastbeleuchtung (Konstruktionstyp nach Zernike) optisch so verändert, dass dessen Aperturblende in eine Intermediärebene zwischen hinterer Objektivbrennebene und Objektebene projiziert wurde (analog zum abblendbaren Phasenkontrast).

Zusätzlich wurde der Kondensor so ausgelegt, dass die Schnittweite seines Linsenkopfes verändert werden konnte. Experimentell konnte ermittelt werden, dass der Linsenkopf des Kondensors zweckmäßigerweise so auszulegen war, dass dessen Schnittweite etwa 11 mm kürzer war, als herstellerseitig für Standardbedingungen vorgesehen. Folglich verliefen die beleuchtenden Strahlen in einem steileren, nahezu lotrechten Winkel zum Objekt.

Die Beleuhtungsverhältnisse können, ebenso wie im Falle des abblendbaren Phasenkontrastes, auch hier mit Hilfe eines Einstell-Okulars kontrolliert werden (Abb. 1).

 

abgeblendetes Dunkelfeld, Einstellfernrohr

Abb. 1: Erzeugung von abgeblendetem Dunkelfeld mittels Phasenkontrast-Kondensor
dezentrierter Lichtring (a), Justierung für konzentrisches (b)
und exzentrisches (c) Dunkelfeld

 

Bei dem in Abb. 1 gezeigten Arrangement wird eine qualitativ gute Dunkelfeldbeleuchtung erzielt, wenn ein Kondensor-Lichtring in den Strahlengang eingebracht wird, dessen Innendurchmesser (ri) leicht über dem Objektfeld-Durchmesser bzw. dem optisch wirksamen Objektiv-Querdurchmesser (ro) liegt.

Abb. 1a stellt einen geeignet dimensionierten Lichtring in dezentrierter Position beim Blick durch eine Phasenkontrast-Einstell-Lupe dar. Abb. 1b zeigt einen analogen Blick durch das Einstellteleskop, nachdem dieser Lichtring für konzentrische Dunkelfeld -Beleuchtung in eine zentrierte Stellung gebracht wurde. Abb. 1 c zeigt schließlich eine leichte Dezentrierung des ringförmigen Lichtdurchlasses zur Erreichung einer exzentrischen (schrägen) abgeblendeten Dunkelfeldbeleuchtung.

Bei der beschriebenen Anordnung änderen sich die optischen Projektionen von Leuchtfeld- und Aperturblende im Strahlengang grundlegend. Die Köhlersche Leuchtfeldblende wird nicht mehr in das Objektfeld projiziert, sondern optisch um eine Distanz von etwa 10 cm zurückversetzt. Eine separate Irisblende kann etwa 2 cm unterhalb der Aperturblende in den Strahlengang eingefügt werden, um in der Objektebene scharf abgebildet zu werden und als Köhler’sche Leuchtfeldblende zu fungieren. In gleicher Weise verlagern sich auch auch die Projektionsebenen von Kollektorlinse und Lichtquelle. Die Aperturblende des Kondensors wird bei dieser Anordnung nicht mehr in die hintere Brennebene des Objektivs projiziert, sondern in eine deutlich objektnähere Ebene, welche in einer Mittelstellung zwischen den üblichen Projektionsebenen von Leuchtfeld- und Aperturblende liegt.

Da Lichtquelle, Kollektor und Leuchtfeldblende optisch jeweils etwa 10 cm weiter als üblich vom Kondensor separiert werden, verlaufen die beleuchtenden Strahlenbündel axialer bzw. weniger schräg. Infolgedessen werden Objekte noch von den beleuchtenden Strahlen erfasst, obgleich die Schnittweite des verwendeten Kondensorkopfes kürzer als werksseitig vorgesehen ausgelegt wurde. Die Aperturblende des Kondensors, welche, wie dargelegt, zwischen Objekt und hintere Objektivbrennebene projiziert wird, kann nun innerhalb weiter Grenzen geschlossen werden, ohne dass Abschattungseffekte auftreten; effektiv nutzbar sind etwa 2/3 ihres Verstellbereichs.

Bei adäquatem Schließen der Aperturblende ergibt sich eine sehr kontrastreiche Darstellung mit optimierter Detailtreue, Konturbetonung und sichtbar gesteigerter Tiefenschärfe. Da die Beleuchtungsstrahlen weniger schräg als bei konventioneller Dunkelfeldbeleuchtung auf das Objekt treffen, können auch Strukturen im Inneren des Objektes deutlicher zur Darstellung kommen (Abb. 2)

 

abgeblendetes Dunkelfeld, konzentrisch kleiner

Abb. 2: Radiolarien, konzentrisch abgeblendetes Dunkelfeld, horizontale Feldweite: 0,8 mm 

 

Abgeblendetes exzentrisches Dunkelfeld:

Wenn bei der vorbeschriebenen Anordnung der Lichtring im Kondensor minimal dezentriert wird (Abb. 1c), so dass dessen innere Randbegrenzung die äußere Grenze des Objektfeldes an einer Stelle geringfügig überlappt, ergibt sich eine schrägere Objektbeleuchtung bei moderat aufgehelltem Hintergrund. Hierdurch kann das dreidimensionale Oberflächenrelief des Objektes deutlicher hervorgehoben werden (Abb. 3 ). Die Aufhellung des Bilduntergrundes ist um so ausgeprägter, je dezentrierter die beleuchtenden Strahlen verlaufen. Auch bei dieser Anordnung kann die Aperturblende wie beschrieben zur Verbesserung der Schärfentiefe und Verringerung von Überstrahlungen eingesetzt werden. Im Rahmen einer nachträglichen Bildbearbeitung kann der Bilduntergrund digital verändert werden, so z. B. von Schwarz nach Blau konvertiert werden. Hierdurch werden Hell-Dunkel -Kontraste abgemildert. Die resultierenden Bilder können im Hinblick auf ihre Dreidimensionalität mit Rasterelektronischen Ansichten vergleichbar sein (Abb. 4),

 

abgeblendetes Dunkelfeld, exzentrischRadiolarie blaugrindig 1 kleiner

Abb. 3 und 4: Radiolarien, Durchmesser jewelis 0,26 mm, exzentrisches abgeblendetes Dunkelfeld
Untergrund in Abb. 4 unverändert, in Abb. 5 digital nach Blau konvertiert.

 

Kombination mit objektivseitiger Abblendung:

Beide Varianten des vorbeschriebenen abgeblendeten Dunkelfeldes - konzentrische und exzentrische Beleuchtung - können auch eingesetzt werden, wenn abblendbare Spezialobjektive für Dunkelfeld zur Verfügung stehen. Die Bildqualität kann in diesem Fall nach Einstellung einer optimalen Kondensor-Abblendung ggf. noch weitergehend verbessert werden, wenn die Irisblende des Objektivs zusätzlich moderat geschlossen wird. Hieraus können in manchen Fällen weitere Anhebungen der Tiefenschärfe und zusätzliche Verringerungen von Überstrahlungseffekten resultieren (Abb. 5 ). Auch bei dieser Variante kann der Bilduntergrund bedarfsweise digital verändert, d.h. aufgehellt und/oder in eine definierte Farbe konvertiert werden (Abb. 6).

 

abgeblendetes Dunkelfeld, IrisobjektivAusschnitt 2 Radiolarien kleiner

Abb. 5 und 6: Radiolarien, Länge jeweils 0,24 mm, exzentrisches abgeblendetes Dunkelfeld,
zusätzliche Objektivabblendung, unbearteiteter Untergrund (Abb. 5), digitale Blau-Konvertierung (Abb. 6)

 

Abblendbares Dunkelfeld an Halbleitermikroskopen:

Ein Mikroskop zur Halbleiter-Inspektion, welches für Untersuchungen im durchfallenden und auffallenden Licht ausgelegt war und über spezielle Objektive für Auflicht-Dunkelfeld verfügte, wurde für experimentelle Zwecke mit einem wie vorbeschrieben modifizierten Durchlicht-Universalkondensor für abgeblendete Dunkelfeldbeleuchtung bestückt. Auf diese Weise konnten Objekte wahlweise in abgeblendetem Durchlicht-Dunkelfeld (siehe oben!), in alleinigem Auflicht-Dunkelfeld, oder simultan in beiden Beleuchtungsarten untersucht werden. Wenn das auffallende und durchfallende Beleuchtungslicht unterschiedlich gefiltert wurde, konnten bei Simultanbeleuchtung im Auf- und Durchlicht zusätzliche Farb-Doppelkontrast-Effekte erreicht werden.

 

Auflicht-Dunkelfeld:

Mittels Auflicht-Illuminator und vorerwähnten Spezialobjektiven für Auflicht-Dunkelfeld (Abb. 7), können geeignete transparente Objekte auch in alleinigem Auflicht-Dunkelfeld mit guten Resultaten untersucht werden, vor allem, wenn feine Oberflächenstrukturen darzustellen sind, welche auftreffendes Licht hinreichend reflektieren . Die Tiefenschärfe kann allerdings im Auflicht in der Regel nicht durch Abblenden gesteigert werden, da die üblichen Illuminatoren und Auflicht-Objektive keine Abblendung des Strahlnganges vorsehen. Daher können Fotodokumente von räumlichen Objekten in befriedigender Gesamtschärfe nur aus Bilderstapeln unterschiedlich fokussierter Einzelbilder erstellt werden, wenn spezielle Software zur Überlagerung von solcher Bilderstapel verwendet wird (sog. Stacking-Software). 

Auch im Auflicht-Dunkelfeld kann die Lichtquelle wahlweise so justiert werden, dass entweder eine konzentrische Objektausleuchtung nach Art eines Ringlichtes entsteht, oder eine exzentrische Schrägbeleuchtung infolge moderater Dejustierung der Lichtquelle.

Abb. 8 zeigt ein Beispiel für ein transparentes Objekt im Auflicht-Dunkelfeld, welches rechnergestützt aus mehreren Einzelbildern zu einer Rekonstruktion von optimaler Schärfe geführt wurde.

 

Abb. 02, Strahlenhang Auflicht S-Spline 2 beschnitten Nik Sharpener S-Spline wdh bearbeitet.

 Abb. 7: Strahlengang eines Illuminators für Auflihct-Dunkelfeld (modifiziert nach Leitz),
beleuchtende Strahlen gelb, abbildende Strahlen rot

 

Auflicht-Dunkelfeld

Abb. 8: Radiolarie, Länge 0,28 mm, Auflicht-Dunkelfeld

 

Simultane Dunkelfeldbeleuchtung im Durch- und Auflicht (Sandwich-Technik):

Überlegene Resultate können auch erreicht werden, wenn beide Methoden - abgeblendetes Durchlicht-Dunkelfeld und simultanes Auflicht-Dznkelfeld - miteinander kombiniert werden.

Bei diesem optischen Arrangement können zusätzliche Kontrastierungseffekte durch geeignete Lichtfilterungen erreicht werden. So beispielsweise kann im Durchlicht-Dunkelfeld eine Beleuchtung mit monochromatischem Blaulicht erfolgen, wodurch Schärfe und Auflösung aufgrund der kurzen Wellenlänge maximiert werden. Dieser monochromatischen Blaulicht-Beleuchtung im durchfallenden Licht kann simultan ein Auflicht-Dunkelfeldbild in ungefiltertem Glühlampenlicht oder komplementärer Farbfilterung überlagert werden. Auf diese Weise kann eine Darstellung feiner oberflächlicher Texturen verbessert werden (Abb. Abb. 9-11).

 

Stern zweiersplit

Abb. 9: Radiolarie, Durchmesser 0,30 mm, konventionelles Dunkelfeld (links), Sandwich-Technik (rechts).

 

Das Objekt von Abb. 9 wurde in Sandwich-Technik wie folgt aufgenommen: Abgeblendetes Durchlicht-Dunkelfeld erfolgte in monochromatischem Blaulicht (486 nm), gleichzeitig wurde eine Auflicht-Dunfelfeld-Beleuchtung in ungefiltertem Halogenlicht durchgeführt. Mehrere unterschiedlich fokussierte Einzelbilder wurden software-gestützt zu einer schärfeoptimierten Rekonstruktion überlagert.

 

Auflicht und Durchlicht-Dunkelfeld grad

Abb. 10: Diatomeen (Durchmesser bzw. Länge jeweils 0,12 mm),
monochromatisches Durchlicht-Dunkelfeld im Blaulicht (konzentrische Abblendung),
simultanes ungefiltertes Auflicht-Dunkelfeld

 

auflicht- und Durchlicht-Dunkelfeld, monochromatisch kleiner

Abb. 11: Diatomeen, Durchmesser 0,14 mm,
konzentrisches Durchlicht-Dunkelfeld in monochromat. Blaulicht,
simultanes Auflicht-Dunkelfeld in gefiltertem Rotlicht

 

Schlussfolgerungen:

Bei allen experimentell evaluierten Ausführungsvarianten konnten die typischen Nachteile konventioneller Dunkelfeldtechnik, speziell vermehrte Randüberstrahlungen und eingeschränkte Tiefenschärfe wirksam überwunden werden.. Im abgeblendeten Dunkelfeld waren die qualitätsverbessernden Effekte bei direktem Vergleich insgesamt ausgeprägter als diejenigen Verbesserungen, welche sich im herkömmlichen Dunkelfeld durch Abblenden einer Objektiv-Irisblende erreichen lassen. Andererseits konnte abgeblendetes Dunkelfeld auch unter Verwendung solcher Dunkelfeldobjektive ausgeführt werden. In diesem Fall kann waren durch eine dezente Abblendung des Objektivs weitere Qualitätsverbesserungen erreichbar, vor allem eine noch weitergehende Erhöhung der Tiefenschärfe und ausgeprägtere Unterbindung von Randüberstrahlungen.

Durch simultane Dunkelfeld-Beleuchtung im Auflicht und Durchlicht konnten die erreichbaren Qualitätsverbesserungen bei geeigneten Objekten noch weitergehend gesteigert werden.

Die verschiedenen Ausführungsvarianten, welche zur Realisierung dieser Beleuchtungsverfahren in Betracht kommen, wurden ebenfalls zum Patent angemeldet.

 

Bisherige Publikationen:

Piper, J.: Verbesserte Darstellung dreidimensionaler transparenter Objekte in modifizierten Dunkelfeld-Techniken und digitalisiertem Interferenzkontrast
(eingereicht: 02.06.2008, angenommen: 03.06.3008)
Mikrokosmos 98, Heft 2, 117-123, 2009

Piper, J.: Improved techniques for imaging of three-dimensional transparent specimens in advanced darkfield and interference contrast modes
(eingereicht: 15.02.2009, angenommen: 06.04.2009)
Microscopy Today, 17 / 3, 20-28, 2009
http://www.microscopy-today.com

Copyright: Joerg Piper, Bad Bertrich, Germany, 2010

 

[Einleitung]
[Luminanz-Kontrast]
[Relief-Phasenkontrast]
[Abgeblendeter Phasenkontrast]
[Abgeblendetes Dunkelfeld]
[Digitaler Phasenkontrast]
[Digitale Mikrofotografie und Analyse]
[Zytometrie im Reflexionskontrast]
[Kapillaroskopie]
[Video-Endoskopie]
[Mathematische Kalkulation kardiovaskulärer Risiken]
[Verhaltensbezogenes Risiko-Management]
[Effizienz der Rehabilitation]
[Diagnostik in der Rehabilitation]
[Komplementäre Medizin]
[Publikationen]
[Lebenslauf]
[Universität Oradea]
[U.N.E. Brüssel]