Aeskulap-Stab
Einleitung
Luminanz-Kontrast
Relief-
Phasenkontrast
Abgeblendeter 
Phasenkontrast
Abgeblendetes 
Dunkelfeld
Digitaler
Phasenkontrast
Mikrofotografie
und Analyse
Zytometrie im
Reflexionskontrast
Kapillaroskopie
Video-Endoskopie
Kardiovaskuläre
Risikokalkulation
Verhaltensbezogenes 
Risiko-Management
Effizienz der
Rehabilitation
Diagnostik in der
Rehabilitation
Komplementäre
Medizin
Publikationen
Lebenslauf
Universität
Oradea
U.N.E. Brüssel
Digitale Mikrofotografie
und Analyse

Eine digitale Dokumentation mikroskopischer Bilder ist sowohl bei Routineanwendungen als auch für wissenschaftliche Fragestellung von hoher Bedeutung. Im Unterschied zu konventionellen analogen Bildern sind digitale Dokumentationstechniken durch verschiedene Vorteile ausgezeichnet.

So können digitale Bilder auf dem Display der jeweiligen Kamera direkt nach ihrer Erstellung gesichtet werden, so dass die Möglichkeit besteht, misslungene Aufnahmen direkt zu wiederholen. Bei Erfordernis kann die Lichtempfindlichkeit des Sensors (ISO-Wert) für jedes Bild an die Helligkeit des Objektes individuell angepasst werden. Digitale Kompakt- oder Bridge-Kameras ermöglichen in den meisten Fällen eine Einstellung auf einen maximalen ISO-Wert von 400; bei digitalen Spiegelreflexkameras kann die ISO-Zahl meist auf 1600 oder 3200 gesteigert werden. Bei hohen ISO-Empfindlichkeiten sind die nachteiligen Effekte des Rauschens digitaler Chips im resultierenden Bild meist geringer sichtbar als die Körnung in analogen Filmen gleicher Empfindlichkeit. Einige hochwertig ausgestattete Digitalkameras können auch im entfesselten TTL-Blitzlichtbetrieb verwendet werden, wobei eine High-Speed-Synchronisation bis zu einer Verschusszeit von 1/2000 oder 1/4000 Sekunde möglich ist.

Mittels üblicher Software zur Bildbearbeitung können auch im Bereich der Mikroskopie digitale Bilder nach ihrer Erstellung weitergehend optimiert werden (sog. Post-Processing); auf diese Weise können grundlegende qualitätsbestimmende Parameter beeinflusst werden (z. B. Gradation, Helligkeit, Kontrast, Farbsättigung, Weiß-Balance, Konturschärfe). Zusätzlich können auch störende Überlagerungen wie mit abgebildete Staubpartikel oder Luftblasen Software-gestützt von Hand bei der Bildnachbearbeitung entfernt werden.

Digitale Bilder können direkt nach ihrer Erstellung ausgedruckt oder bei Bedarf in andere Präsentationen oder Dokumente, z. B. histopathologische Befundberichte integriert werden. Zusätzlich können sie auch internetbasiert auf direktem Wege anderen Adressaten zugänglich gemacht werden. In speziellen medizinischen Bereichen, beispielsweise Histopathologie, Zytopathologie, Hämato-Onkologie, können schwierig einzuordnende Befunde bei Bedarf mittels telemedizinscher Konferenzen unter Überbrückung hoher Distanzen auf direktem Wege diskutiert werden, wenn digitale Bilder zur Verfügung stehen.

Bereits vor Jahrzehnten hatten die maßgeblichen Hersteller hochwertiger Lichtmikroskope verschiedene Module entwickelt, um ihre Mikroskope an systemkonforme analoge Kameras zu adaptieren. Solche Baukomponenten wurden für Digitalkameras bisher nicht in vergleichbarem Umfang entwickelt. Vielmehr werden für die digitale Mikrofotografie vornehmlich spezielle Aufsatzkameras angeboten, die nur an einem Mikroskop für Mikrofotografie verwendet werden können.

Unter ökonomischem Aspekt stellen handelsübliche Digital-Kameras eine attraktive Alternativlösung für mikrofotografische Zwecke dar, da sie wesentlich preiswerter zu erwerben sind und in vergleichsweise hoher Stückzahl hergestellt werden. Hinzu kommt, dass Highend-Digitalkameras mittlerweile hochauflösende Bilder ermöglichen, die anlogen Kleinbildfotos vergleichbar sind.

Einschränkend ist allerdings zu erwähnen, dass bei weitem nicht jede Digitalkamera für Mikrofotografie verwendbar ist. Im Abhängigkeit vom jeweiligen Kameramodell können verschiedene Artefakte, Bildvignettierungen, unzureichende Bildausleuchtung, eingeschränkte Konturschärfe und andere technische Gründe einer sinnvollen Verwendung im Wege stehen.

Vor diesem Hintergrund wurden verschiedene technische Lösungen entwickelt, um digitale Mikrofotografie mit handelsüblichen Digitalkameras zu realisieren. Die jeweiligen Kameramodelle wurden systematisch und ausgiebig in der Praxis getestet. Hierbei wurden verschiedene Bautypen digitaler Kameras berücksichtigt (Kompakt-, Bridge- bzw. Prosumer-Kameras und einäugige Spiegelreflex-Kameras). Unter Verwendung dieser verschiedenen Kamera-Typen wurden alle Aspekte der mechanischen und optischen Adaption getestet, weiterhin auch Methoden der Belichtungsmessung, der manuellen Fokussierung, der Bildkontrolle sowie der Verwendung von Elektronenblitzgeräten im manuellen und TTL-gesteuerten Automatikbetrieb. Darüber hinaus wurden die verschiedenen in Betracht kommenden Artefakte evaluiert, die speziell beim Einsatz solcher Digitalkameras an einem Mikroskop entstehen können. Weitergehend wurde auch der Einsatz monochromatischer Filter und anderer lichtmodulierender Filter erprobt; hierfür standen verschiedene Interferenzfilter zur Verfügung, welche für astronomische Anwendungen entwickelt wurden. Die Qualität der jeweiligen digitalen Bilder wurde visuell analysiert und klassifiziert, und zwar auf der Basis hochauflösender Monitor-Bilder und großformatiger Farb-Ausdrucke. Weiterhin wurden auch verschiedene Software-gestützte Methoden des Post-Processings evaluiert; hier lag ein besonderer Schwerpunkt in der Erprobung von rechnergestützten Bildüberlagerungen (Stacking) und Sandwich-Techniken. Diese Methoden setzen spezielle Software-Lösungen voraus; sie dienen einer Optimierung der sichtbaren Tiefenschärfe, einer Beseitigung von über- oder unterbelichteten Bildzonen und eine Verbesserung der Detailerkennung.

Die durchgeführten Evaluationen führten zu dem Resultat, dass verschiedene Digitalkameras (Kompakt, Bridge, Spiegelreflex) zu jeweils brauchbaren Ergebnissen führen können, wenn sie in geeigneter Weise an einem Mikroskop adaptiert werden. Daher können solche Kameras als praktikable und attraktive Optionen betrachtet werden, welche deutlich preiswerter als spezielle mikroskopische Aufsatzkameras sind und nebenbei auch für andere fotografische Zwecke einsetzbar bleiben. Es hat sich gezeigt, dass die Bildqualität solcher Digitalaufnahmen mit der Qualität herkömmlicher analoger Kleinbild-Aufnahmen im Format 24 x 36 mm vergleichbar ist, wenn die Auflösung des Sensors in einem Bereich von 6 – 8 Megapixeln liegt.

Wenn monochromatische Grünfilter verwendet werden, kann die Qualität monochromer Digitalbilder weitergehend optimiert werden. Insbesondere werden Kontrast, Schärfe und Bildauflösung nochmals gesteigert, da jegliche chromatische Rest-Aberration des optischen Systems ausgeschaltet wird. Verschiedene astronomische Filter, speziell Kontrast-Booster-Filter und Apo-Filter können auch in der Mikroskopie als RGB-Verstärker eingesetzt werden. Diese Filter führen zu einer selektiven Verstärkung der drei Primärfarben Rot, Grün und Blau. UV- und Infrarot-Cut-Filter sowie astronomische Randsaum-Killer-Filter können ultraviolettes, infrarotes bzw. violettes und kurzwelliges Blaulicht blockieren. Hierdurch kann die Qualität von digitalen Farbaufnahmen wesentlich verbessert werden. Diese Verbesserungen beziehen sich auf Farbsättigung, Farbreinheit, Konturschärfe und Auflösungsvermögen; sie sind gleichermaßen bei der visuellen Mikroskopie als auch in mikrofotografischen Bildern erkennbar. Schließlich können verschiedene moderne digitale Kompaktkameras neben einer Fotodokumentation auch für Videoaufnahmen bewegter Objekte mit Erfolg eingesetzt werden.

Bei dreidimensionalen Objekten ergeben sich durch geeignete Überlagerungstechniken Bildrekonstruktionen von ungeahnter Raumtiefe, in denen letztlich jegliche störende Bildunschärfe eliminiert werden kann. Durch geeignete Verarbeitung von Serienbild-basierten Belichtungsreihen (HDR- und DRI-Techniken) können bei vorhandenen erhöhten Hell-Dunkel-Kontrasten kontrastoptimierte Bilder rekonstruiert werden, welche frei von sichtbaren über- oder unterbelichteten Strukturen sind. Die Detailerkennung kann auf diese Weise durchgreifend verbessert werden.

Weitere Optimierungen der fotografischen Präsentation können durch digitale Invertierungen oder KOnvertierungen des Bilduntergrundes in andere Farb- oder Helligkeitsstufen erreicht werden; beispielhaft sei in diesem Kontext aud die Möglichkeiten eines digitalisierten Dunkelfeldes hingewiesen, welches optisch erzeugten Dunkelfelddarstellungen sichtbar überlegen sein kann.

Zusammenfassend erschließt die digitale Mikrofotografie insgesamt ein breites Spektrum erweiterter Visualisierungstechniken, welches die Möglichkeiten konventioneller Analogfotografie deutlich übersteigt.

 

Abbildung 1:
Native Epithelzelle, Objektiv Öl 100x, Phasenkontrast,
Zwei-Farben-Sandwich Technik, Überlagerung (Stack) von 11 Einzelaufnahmen,
Glühlampen- und Blitzlicht-Beleuchtung
 

Abbildung 2:
Native Epithelzelle, Objektiv Öl 100x, Phasenkontrast,
Monochromatisches Grünlicht, Überlagerung (Stack) von 11 Einzelbildern,
Detailansicht mit subzellulären Strukturen, horizontale Feldweite: ca. 0,01 mm
 

Abbildung 3 und 4:
Seestern-Arm, Stereomikroskop, Auflicht, Objektiv 4x,
konventionelle Einzelaufnahme (links), Überlagerung (Stack) von 7 Einzelbildern (rechts)
 

Abbildung 5:
Vergleich verschiedener, für Mikrofotografie geeigneter Digitalkameras
a: Seeigelskelett, Kompaktkamera, 5 Megapixel (Canon Powershot A 95).
b: Menschliche Retina, Ultra-Kompaktkamera, 6 Megapixel (Casio Exilim EX-Z 110)
c: Mücke, digitale Spiegelreflexkamera, 8 Megapixel, Blitzlichtbeleuchtung (Canon EOS 350D)
d: Lebende Mückelarve, Bridge-Kamera, 7,1 Megapixel, Blitzlichtbeleuchtung (Olympus Camedia C7070)
(Fotos: Timm Piper)
 

Abbildung 6:
Bacillus megatherium, Phasenkontrast, Objektiv Öl 100x, unterschiedliche Grünfiltertechniken
a: ohne Filter
b: Gelb-Grün-Filter
c: monochromatischer Grünfilter
d: monochromatischer Grünfilter, Schwarz-Weiß-Ansicht
 

Abbildung 7:
Software gestützte Veränderungen der Gradationskurve, Kratzer auf einer Polymer-Schicht,
Verbesserte Darstellung der Oberflächentextur durch Farbkontraste
a: herkömmliches Hellfeld (Foto: Timm Piper)
b – d: Mehrfarben-Bilder, erstellt durch schrittweise Veränderungen der Gradationskurven
 

Abbildung 8:
Knorpelzellen, Blitzlicht, Objektiv 40x,
ohne Filter (links), astronomischer Kontrast-Booster-Filter (rechts),
Sichtbare Verbesserung der Farbdarstellung durch RGB-Verstärkung

 

HDR Tafel

Abbildung 9:
Schmettertlingsflügel im polarisierten Licht, Lambda-Kompensator,
horizontale Feldweite: 2 mm, Belichtungsumfang: 9 EV,
vier representative Einzelaufnahmen unterschiedlicher Belichtung (links),
HDR-Rekonstruktion mit idealer Aussteuerung von Helligkeit und Kontrast (rechts),
erstellt aus einer Belichtungsreihe von 2 s bis 1/ 250 s (10 Einzelbilder)

 

Abb. 14, ICT 14 Combine u. Picolay var.ICT~997_2_s100_c30 bearbeitet Untergrund besser schwarz heller

Abb. 15, ICT 11 rectangle_out bearbeitet Ausschnitt beserer Untergrund schwarz

Abb. 10 und 11: Radiolarien, digitalisiertes Dunkelfeld, basierend auf Interferenzkontrast
(Objektlänge: 0,30 mm in Abb. oben, 0,26 mm in Abb. unten)

 

Publikationen:

Piper, J.: Technische Realisation digitaler Mikrofotografie mit handelsüblichen Consumer-Digitalkameras
Teil 1: Allgemeine Aspekte, Verwendung von Kompakt- und Bridge-Kameras
(eingereicht: 07.08.2006, angenommen: 10.08.2006)
Mikrokosmos 96, Heft 2, 111-124, 2007

Piper, J.: Technische Realisation digitaler Mikrofotografie mit handelsüblichen Consumer-Digitalkameras
Teil 2: Digitale Spiegelreflex-Kameras, Elektronenblitz-Fotografie, zukünftige Entwicklungen
(eingereicht: 07.08.2006, angenommen: 10.08.2006)
Mikrokosmos 96, Heft 3, 173-182, 2007

Piper, J.: Adapting consumer digital cameras for photomicrography: 
Technical aspects
(eingereicht: 18.09.2006, angenommen: 04.10.2006)
European Microscopy and Analysis106, S5-8, 2007

Piper, J.: Erweiterte Techniken zur Software-gestützten dreidimensionalen Rekonstruktion und Schärfeoptimierung mikrofotografischer Bilder.
(eingereicht: 21.10.2006, angenommen: 26.10.2006)
Mikrokosmos 97, Heft 4, 221-229, 2008

Piper, J.: Einsatz astronomischer Filter in Mikroskopie und Mikrofotografie.
(eingereicht: 22.01.2007, angenommen: 23.01.2007)
Mikrokosmos 97, Heft 1, 43-49, 2008

Piper, J.: Ringartefakte in Mikroskopie und digitaler Mikrofotografie
Klassifikation, Entstehung, physikalische Beschreibung.
(eingereicht: 05.02.2007, angenommen: 07.02.2007)
Mikrokosmos 97, Heft 3, 169-176, 2008

Piper, J.: Use of astronomy filters in light microscopy and photomicrography.
(eingereicht: 20.02.2007, angenommen: 2104.200
Microscopy Today, 15 / 3, 30-35, 2007
(Organ der Microscopy Society of America / MSA)

Piper, J.: Multicolor contrast effects by monochromatic astro filters – utilization in light microscopy and photomicrography.
(eingereicht: 12.08.2008, angenommen: 06.12.2008)
Microscopy Today 16 / 5, 20-26, 2008
(Organ der Microscopy Society of America / MSA)

 Piper, J.: RGB-Splitting and multi-shot techniques in digital photomicrography – utilization of astronomic RGB-filters in true color imaging.
(eingereicht: 17.10.2008, angenommen: 13.11.2008)
Microscopy Today 17 / 1, 48-51, 2009
(Organ der Microscopy Society of America / MSA)

Piper, J.: Verwendung von Astro-Filtern in Mikroskopie und Mikrofotografie
- eine systematische Einführung
Monographie für Fa. Baader-Planetarium, 43 Druckseiten, Juli 2008

Piper, J.: Verwendung von Baader RGB-Filtern (Contrast-Booster- und Semi-Apo-Filter) in Mikroskopie und Mikrofotografie
- eine praxisbezogene Übersicht -
Monographie für Fa. Baader-Planetarium, 8 Druckseiten, Jan. 2009

Piper, J.: Verwendung monochromatischer Astro-Filter in Mikroskopie und Mikrofotografie
- eine praxisbezogene Übersicht -
Monographie für Fa. Baader-Planetarium, 8 Druckseiten, Jan. 2009

Piper, J.: Einsatz  von Baader-RGB-Farbfiltern bei Multi-Shot-Techniken in Mikroskopie und Mikrofotografie
- eine praxisbezogene Übersicht
Monographie für Fa. Baader-Planetarium, 7 Druckseiten, Jan. 2009

Piper, J.: Einsatz des Baader Contrast-Booster und Semi-Apo-Filters in der Allgemeinfotografie
- eine kurz gefasste Übersicht
Monographie für Fa. Baader-Planetarium, 8 Druckseiten, Jan. 2009

Piper, J.: Einsatz von Baader RGB-CCD-Filtern in der Allgemeinfotografie
- eine kurz gefasste Einführung in Multi-Shot-Techniken
Monographie für Fa. Baader-Planetarium, 5 Druckseiten, Jan. 2009

Piper, J.: Software-based three dimensional reconstructions and enhancements of focal depth in microphotographic images
(eingereicht: 27. März 2007, angenommen: 15. Mai 2007)
In: Méndez-Vilas, A., Diaz, J. (Eds): Modern Research and Educational Topics in Microscopy, Vol. 2, 900-905
Formatex Research Center, Badajoz, SPAIN, 2007
ISBN-13: 978-84-611-9420-9
http://www.formatex.org/microscopy3/index.htm
http://www.formatex.org/microscopy3/pdf/pp900-905.pdf

Piper, J.: Fotodokumentation großflächiger Objekte - ein Methodenvergleich.
(eingereicht: 18. Oktober 2007, angenommen: 22. Oktober 2007)
Mikrokosmos 97, Heft 5, 304-307, 2008

Piper, J.: Wide field and deep focus imaging in photomicrography - optical and software-based techniques.
(eingereicht: 17.12.2007, angenommen: 30.12.2007)
Microscopy Today 16 / 2, 32-37, 2008
(Organ der Microscopy Society of America / MSA)

Piper. J.: Use of software to enhance depth of field and improve focus in photomicrography.
(eingereicht: 02.01.2008, angenommen: 06.03.2008)
European Microscopy and Analysis 113, 15-19, May 2008

Piper, J.: Verbesserte Darstellung hoher Kontrastumfänge in der Mikrofotografie (HDR- und DRI-Techniken).
(eingereicht: 09.04.2008, angenommen: 11.04.2008)
Mikrokosmos 97, Heft 6, 375-382, 2008

Piper, J.: Verbesserte Darstellung dreidimensionaler transparenter Objekte in modifizierten Dunkelfeld-Techniken und digitalisiertem Interferenzkontrast
(eingereicht: 02.06.2008, angenommen: 03.06.3008)
Mikrokosmos 98, Heft 2, 117-123, 2009

Piper, J.: Image processing for the optimization of dynamic range in photomicrography.
(eingereicht: 27.06.2008, angenommen: 05.09.2008)
European Microscopy and Analysis 117, 23 (1), S5-S9 (EU), 2009

Piper, J.: Improved techniques for imaging of three-dimensional transparent specimens in advanced darkfield and interference contrast modes.
(eingereicht: 15.02.2009, angenommen: 06.04.2009)
Microscopy Today, 17 / 3, 20-28, 2009

Piper, J.: Software-gestützte Kontrastierung feiner Helligkeitsdifferenzen in Hellfeldbildern.
(eingereicht: 20.01.09, angenommen: 02.02.2009)
Mikrokosmos 98, Heft 5, 315-318, 2009

Piper, J.: Ultra-high contrast amplifying in bright-field images.
(eingereicht: 11.07.2009, angenommen: 16.07.2009)
Microscopy Today x / y, zz-zz, 2010
(Organ der Microscopy Society of America / MSA)
Cambridge Universtiy Press
doi: 10.1017/S1551929510000222

Piper, J.: Software-based stacking techniques to enhance depth of field and dynamic range in digital photomicrography. In: Hewitson, T.D., Darby, I.A. (Hrsg.): Springer Protocols, Methods in molecular biology 611, Histology protocols, Chapter 16, 193-210, Humana Press, 2010

Piper, J., Chmela, G.: Optimierte Beobachtung und Fotodokumentation fein strukturierter Diatomeenschalen im Grenzbereich lichtmikroskopischer Auflösung
(eingereicht: 12.08.2009, angenommen: 14.08.2009)
Mikrokosmos 99, Heft 2, 115-122, 2010

Piper, J., Chmela, G.: Advanced techniques in observation and photomicrography of subcellular structures in diatom shells
(eingereicht: 11.09.2009, angenommen: 12.09.2009 )
Microscopy Today x / y, zz-zz, 2009
(Organ der Microscopy Society of America / MSA)
Cambridge University Press

Piper, J.: Image processing for the optimization of dynamic range and ultra-high contrast amplification in photomicrography
(eingereicht: 06.03.2010, angenommen: 12.03.2010)
In: Méndez-Vilas, A., Diaz, J. (Eds): Modern Research and Educational Topics in Microscopy, Vol. 3, xxx-xxx
Formatex Research Center, Badajoz, SPAIN, 2010
ISBN
http://www.formatex.org/microscopy3/index.htm
http://www.formatex.org/microscopy3/pdf/pp900-905.pdf

Piper J.: High-grade imaging of diatoms and radiolarians in light microscopy – optical and software-based techniques
(eingereicht: 05.05.2010, angenommen: )
Diatom Research

 

Copyright: Joerg Piper, Bad Bertrich, Germany, 2010

     

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