Aeskulap-Stab
Einleitung
Luminanz-Kontrast
Relief-
Phasenkontrast
Abgeblendeter 
Phasenkontrast
Abgeblendetes 
Dunkelfeld
Digitaler
Phasenkontrast
Mikrofotografie
und Analyse
Zytometrie im
Reflexionskontrast
Kapillaroskopie
Video-Endoskopie
Kardiovaskuläre
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Verhaltensbezogenes 
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Effizienz der
Rehabilitation
Diagnostik in der
Rehabilitation
Komplementäre
Medizin
Publikationen
Lebenslauf
Universität
Oradea
U.N.E. Brüssel
Digitaler Phasenkontrast

In normalen Hellfeldbildern können üblicherweise nur Absorptions-Objekte adäquat dargestellt werden, welche die Amplitude des durchfallenden Lichtes hinreichend verändern. Die meisten ungefärbten Objekte, welche im Unterschied zu Absorptionsobjekten auch als „Phasenobjekte“ bezeichnet werden, verursachen bei Hellfeldbeleuchtung nur minimale Absorptionen und folgerichtig auch nur sehr geringe Helligkeitsdifferenzen, so dass sie sich einer befriedigenden Darstellung im Hellfeld entziehen.

Geeignete Computerprogramme zur Bildbearbeitung eröffnen die Möglichkeit, digital erstellte Hellfeld-Fotos so zu verändern, dass auch feinste Absorptionsunterschiede bzw. Helligkeitsabweichungen in hohem und stufenlos regulierbarem Kontrast sichtbar werden. Auf diese Weise können Aufnahmen rekonstruiert werden, deren visuelle Information mit derjenigen anderer geeigneter Beleuchtungsmethoden (z. B. Phasenkontrast) vergleichbar ist; gelegentlich kann die Hellfeld-basierte Bildrekonstruktion sogar noch eine überlegene Darstellung im Hinblick auf Schärfe und Detailerkennung bewirken, so dass sie auch als interessante Ergänzung zu optischen Kontrastierungsverfahren fungieren kann.

Im Unterschied zur Phasenkontrastbeleuchtung sind Halo-Artefakte deutlich geringer ausgeprägt oder fehlen gänzlich. In den verwendeten Objektiven kann auf Phasenringe verzichtet werden kann, so dass Standardobjektive eingesetzt werden können. Die Apertur des Kondensors kann in vollem Umfang optisch wirksam sein, da das beleuchtende Licht nicht durch einen schmalen Lichtring geführt werden muss. Durch diese optischen Gegebenheiten kann ein oftmals erkennbarer “Qualitätsvorsprung” gegenüber herkömlichen Phasenkontrastbildern erklärt werden.

Im Unterschied zu Phasen- und Interferenzkontrast ergibt sich in vielen Fällen ein deutlich gesteigerter Objektkontrast, vor allem bei sehr filigranen Strukturen von minimaler optischer Dichte. 

 

Software-bezogene Aspekte:

Jedes normale Bildbearbeitungsprogramm bietet die Möglichkeit, in Digitalbildern Helligkeit und Kontrast zu verändern. Zusätzlich kann in einigen Programmen auch der Gradationskurvenverlauf beeinflusst werden, woraus sich weitere Optimierungen der Kontrast- und Helligkeitsverteilung innerhalb eines Bildes ergeben. Bei diesen Bearbeitungsalgorithmen wird allerdings die Tonwerttiefe des Ausgangsbildes nicht verändert, sondern es wird lediglich die Gewichtung heller und dunkler Bildpunkte innerhalb eines vorgegebenen Tonwertumfanges verändert. Aus diesem Grunde können kontrastschwache Bilder mit diesen einfachen Bearbeitungsverfahren nur in begrenztem Umfang aufgearbeitet werden. Mit diesen Methoden gelingt es nach Maßgabe eigener Tests nicht, beispielsweise eine ungefärbte Zelle bei Hellfeldbeleuchtung adäquat im Kontrast nachzuverstärken. Hinzu kommt, dass bei einer allzu drastischen Anhebung des Bildkontrastes in aller Regel unbrauchbare Ergebnisse resultieren, da in erster Linie nur noch das vorhandene Hintergrundrauschen verstärkt wird, so dass die eigentlich interessierenden Bilddetails durch „Übersteuerung“ verloren gehen.

Aus den vorerwähnten Gründen müssen Hellfeldaufnahmen von ungefärbten Objekten zunächst mit speziellen Software-Modulen vorbehandelt werden, welche den üblicherweise begrenzten Tonwertumfang erhöhen. Diese Bearbeitungstechnik wird als HDR (High Dynamic Range) bzw. HDRI (High Dynamic Range Increase) bezeichnet.

Es hat sich durch eigene Vergleichstests gezeigt, dass für die Darstellung von ungefärbten Objekten in Hellfeldbildern nur eine dem Autor bekannte HDR-Software geeignet ist, nämlich Photomatix pro (HDR Soft, 2008, Sasso, 2008). Diese Software bietet verschiedene Bearbeitungsmodule an, welche vom Anwender frei gewählt werden können. Für den beabsichtigten Verwendungszweck hat sich das Photomatix-Modul „Details-Enhancer“ als brauchbar erwiesen; die Presets des „Details-Enhancers“ sind so einzustellen, dass eine maximale Kontrastverstärkung resultiert.. Dieses Tool ist in der Lage, die Anzahl der Tonwerte von beispielsweise 256 in einem üblichen 8-Bit-Bild auf etwa 4.3 Billionen Tonwerte pro Farbkanal anzuheben. In einem so erstellten HDR-Bild werden die interessierenden Strukturen des ungefärbten Objektes schon deutlich im Kontrast angehoben, ohne dass es zu störendem Bildrauschen oder anderen erkennbaren Artefakten kommt.

In einem zweiten Bearbeitungsschritt kann dieses HDR-Bild mit herkömmlichen Bildbearbeitungsprogrammen auf übliche Weise hinsichtlich Kontrastumfang und Gradation weitergehend optimiert werden. Durch die vorausgegangene vorbereitende Umgestaltung des Bildes wurden neue Voraussetzungen geschaffen, diese konventionellen Nachbearbeitungsinstrumente so moderat einzusetzen, dass nachteilige Übersteuerungseffekte vermieden und dennoch durchgreifende Kontrastverbesserungen ermöglicht werden.

Bedarfsweise kann in einem letzten Bearbeitungsschritt das endgültige hochkontrastierte Farbbild in eine Schwarz-Weiß-Ansicht konvertiert werden. Sofern das Objekt keine Eigenfarbe besitzt, können durch eine solche Schwarz-Weiß-Umwandlung feine Tonwertunterschiede ggf. noch deutlicher herausgearbeitet werden.

 

Fotographische Aspekte:

Bei der Erstellung des Ausgangsbildmaterials ist zu beachten, dass die Hellfeldbilder keinesfalls überbelichtet sein dürfen, da ansonsten vorhandene feine Helligkeitsunterschiede von vornherein verloren gehen. Es hat sich eher als vorteilhaft erwiesen, diese Aufnahmen tendenziell geringfügig unterzubelichten, da hierdurch ein höherer Ausgangskontrast erreicht wird. Die Aperturblende kann ebenso wie bei Absorptionsobjekten durch moderates Schließen zur Qualitätsverbesserung des Bildes beitragen (Erhöhung der Tiefenschärfe, verbesserte Darstellung feiner Konturverläufe).

HDR-Software erfordert für die Bearbeitung mindestens zwei Einzelbilder, welche in den Bearbeitungsprozess eingehen und zu einer HDR-Rekonstruktion führen. In der hier beschriebenen Verwendung ist völlig ausreichend, von dem interessierenden Objekt nur eine Einzelaufnahme anzufertigen und diese auf dem Rechner unter zwei unterschiedlichen Dateinahmen abzuspeichern, d. h. rein elektronisch zu duplizieren. Die so am Rechner kreierten identischen Bildpaare werden von Photomatix pro mit einwandfreiem Ergebnis verarbeitet.

Grundsätzlich besteht alternativ auch die Möglichkeit, von einem unbewegten Objekt zwei separate Einzelaufnahmen anzufertigen, ggf. auch bei leicht differierender Belichtung, und diese auf direktem Weg in den Bearbeitungsprozess einzubringen.

 

Ergebnisse:

Die erhältlichen kontrastoptimierten Hellfeldbilder zeigen in verblüffender Qualität alle interessierenden strukturellen Details auch in typischen ungefärbten Phasenobjekten (Abb. 1 und 2). Die digitalen Phasenkontrastbilder beider Abbildungen wurden mittels ultra-hoch verstärkter Kontrastverstärkung aus den Hellfeldbildern (Abb.. 1 a und 2 a) erstellt. gezeigt werden jeweils die farbigen Rekonstruktionen und ihre korrespondierenden Schwarz-Weiß-Ansichten.

 

Hellfeld-Phasenkontrast Alaun kleiner Rand verbessert

Abb. 1: Alaun-Kristallisation unter Deckglas, horizontale Feldweite: 0,20 mm,
Hellfeld (a), konventioneller Phasenkontrast (b), digitaler Phasenkontrast (c und d)

 

Hellfeld-Phasenkontrast, Epithel kleiner

Abb. 2: Natives Speichelpräparat mit Epithelzelle und Mundbakterien, horizontale Feldweite: 0,10 mm,
Hellfeld (a), konventioneller Phasenkontrast (b), digitaler Phasenkontrast, (c und d)

 

Wenn ein Vergleich zur Phasenkontrasttechnik gezogen wird, ist festzustellen, dass die visuelle Information der kontrastoptimierten Hellfeldbilder derjenigen von Phasenkontrastbildern nicht nachsteht. Tendenziell scheinen in vielen Fällen sogar feinere Strukturen erkennbar als bei Phasenkontrastbeleuchtung (so beispielsweise feine Polierspuren auf der Oberfläche von Objektträgern). Da bei Hellfeldtechnik kein Phasenring im Objektiv notwendig und eine höhere Beleuchtungsapertur des Kondensors nutzbar ist, ergibt sich auch aus grundlegenden physikalischen Gesetzen, dass die reale Bildauflösung höher liegen kann als in einer korrespondierenden Phasenkontrastaufnahme. Auch die durch moderates Schließen der Aperturblende erreichbare Anhebung der Tiefenschärfe kann der Gesamtqualität des jeweiligen Fotos zugute kommen. Helle Randsäume (Halo -Phänomene) können auch bei einer Computer-gestützten Kontrastanhebung in Hellfeldbildern entstehen; sie sind allerdings meist deutlich geringer ausgeprägt als bei Phasenkontrast-Bildern.

Vorteilhaft wirkt sich auch aus, dass die Intensität der Kontrastanhebung vom Anwender stufenlos verändert werden kann. Daher ist dieses Verfahren auch sehr gut geeignet, herkömmliche Absorptionsobjekte, welche im Hellfeld fotografiert werden, hinsichtlich erkennbarer Bilddetails durchgreifend aufzuwerten (Abb. 3). Gefärbte Schnitte, wie in Abb. 3 gezeigt, können in herkömmlichem Phasenkontrast in der Regel nicht befriedigend dargestellt werden, wohingegen die rechnrgestützte Kontrastanpassung des Hellfeldbildes zu einer verbesserten visuellen Information führt.

 

Piniennadeln Variante kleiner

Abb. 3: Piniennadel, gefärbter Querschnitt, horizontale Feldweite: 1,5 mm
koventionelles Hellfeld (a), kontrastverstärktes Hellfeld (b)
Foto: Timm Piper

 

Hersteller von Digitalmikroskopen könnten die beschriebenen Bearbeitungsalgorithmen aufgreifen und in Monitor-basierte Geräte zur Life-Beobachtung integrieren. Unter der Voraussetzung einer hinreichend schnellen Bildaufbaurate könnte so der Weg frei werden, einen neuen Typ von digitalen Hellfeld-Mikroskopen zu entwickeln. Diese Geräte könnten für direkte Lebendbeobachtungen traditioneller Phasenobjekte in hervorragender Weise verwendet und die jeweiligen Objekte in stufenlos modulierbarem Kontrast darstellen. Bei dieser digital modifizierten Hellfeldbeleuchtung blieben alle optischen Vorzüge der Hellfeld-Mikroskopie uneingeschränkt nutzbar, und die optischen Hilfsmittel der Phasenkontrast-Mikroskopie wären entbehrlich.

 

Bisherige Veröffentlichungen:

Piper, J.: Software-gestützte Kontrastierung feiner Helligkeitsdifferenzen in Hellfeldbildern
(eingereicht: 20.01.09, angenommen: 02.02.2009)
Mikrokosmos 98, Heft 5, 315-318, 2009

Piper, J.: Ultra-high contrast amplifying in bright-field images
(eingereicht: 11.07.2009, angenommen: 16.07.2009)
Microscopy Today x / y, zz-zz, 2010
(Organ der Microscopy Society of America / MSA)
Cambridge Universtiy Press
doi: 10.1017/S1551929510000222

Copyright: Joerg Piper, Bad Bertrich, Germany, 2010

 

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