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Phasenkontrast stellt eine weitverbreitete lichtmikroskopische Untersuchungsmethode dar, um farblose transparente Objekte, beispielsweise ungefärbte lebende Zellen und Mikroorganismen zu untersuchen, welche in aller Regel nur über sehr geringen Eigenkontrast verfügen. Solche Phasenobjekte absorbieren Licht entweder überhaupt nicht oder nur in äußerst geringem Maße, so dass die Amplitude des durchstrahlenden Lichtes nahezu unverändert bleibt. Allerdings verschieben diese Objekte die Phase des sie durchdringenden Lichtes um etwa ¼ der jeweiligen Wellenlänge (Lambda/4). Solche Phasendifferenzen können auf direktem Wege weder vom menschlichen Auge erkannt noch auf einem fotographischen Film dargestellt werden. In 1934/35 entwickelte der holländische Physiker Fritz Zernike Phasenkontrast als spezielle Beleuchtungsmethode, um Phasendifferenzen in sichtbare Amplitudendifferenzen zu transformieren. Je nach optischer Auslegung des Mikroskopes, können Phasenkontrast-Untersuchungen im positiven oder negativen Phasenkontrast durchgeführt werden. In positivem Phasenkontrast erscheint das Objekt grau kontrastiert auf hellerem Untergrund, umrandet von einem ebenfalls helleren Randsaum (Halo). Im negativen Phasenkontrast ist der Untergrund dunkler und das Objekt erscheint heller, umgeben von einem dunklen Halo. Die hellen und dunklen Halos sind typische Artefakte, welche als spezifische Nachteile des Phasenkontrasts betrachtet werden können; sie sind besonders ausgeprägt, wenn die jeweiligen Objekte höhergradige Phasenverschiebungen bewirken. Vor einiger Zeit wurde von einigen Herstellern das Design von Phasenkontrast-Objektiven verändert, so dass durch Modifikationen der jeweiligen Phasenringe eine Verringerung der Halo-Effekte erreicht werden konnte (sog. Apodized Phasenkontrast). Sämtliche erwähnten Varianten des Phasenkontrastes führen nicht zu dreidimensionalen Relief-betonten Bildern, wie sie im Interferenz-Kontrast entstehen. Im Vergleich zur Hellfeld-Beleuchtung ist die Tiefenschärfe im Phasenkontrast reduziert, da die Aperturblende des Kondesors voll geöffnet bleiben muss. Die Kontrast-Intensität der Phasenkontrast-Bilder ist abhängig von der Differenz der Brechungsindizes des Objektes und seines umgebenden Mediums, zusätzlich auch von der Schichtdicke und dem nativen Kontrast des Objektes. Die Qualität von Phasenkontrast-Bildern wird in hohem Maße vom Korrektionsaufwand des jeweiligen Objektivs bestimmt. Vorhandene chromatische oder sphärische Restabbildungsfehler verringern die Qualität von Phasenkontrast-Bildern mehr als bei Hellfeld-Beleuchtung. Schließlich kann brauchtbarer Phasenkontrast nur realisiert werden, wenn die Phasen-Ringe in den Objektiven und die ringförmigen Lichtmasken im zugehörigen Kondensor exakt aufeinander abgestimmt sind. Aus diesem Grunde können Fehljustierungen mit verringerter Bildqualität entstehen, wenn Objektive und Kondensoren unterschiedlicher Hersteller an ein und dem selben Mikroskop verwendet werden sollen. Relief-Phasen Kontrast wurde vom Autor als neue Variante des Phasenkontrastes entwickelt, um die Qualität der herkömmlichen Phasenkontrast-Bilder weitergehend zu steigern. Die resultierenden Bilder sind von höherem Kontrast, vermehrter Tiefenschärfe, verringerten Halo-Artefakten und verbesserter Planität im Falle vorhandener sphärischer Restabbildungsfehler. Die Objekte erscheinen meist auch in verbesserter Konturschärfe; der dreidimensionale Bildeindruck ähnelt Interferenzkontrast-Bildern. Die Planität des mikroskopischen Bildes wird verbessert, vor allem, wenn nicht plankorrigierte Objektive verwendet werden. Aber auch, wenn hochkorrigierte Objektive eingesetzt werden (z. B. Planachromate oder Planapochromate), zeigen die resultierenden Bilder einen gesteigerten Kontrast bei verbesserter Tiefenschärfe und höherer Dreidimensionalität. Bei Vergleichsziehung zum Interferenz-Kontrast bieten mikroskopische Bilder im Relief-Phasenkontrast oftmals einen höheren Detailreichtum bzw. ergänzende Bildinformationen. Im Unterschied zum herkömmlichen Phasenkontrast kann die Aperturblende des Kondensors in ähnlicher Weise wie bei Hellfeld-Beleuchtung moderat geschlossen werden. Daher kann die Bildqualität im Relief-Phasenkontrast auch durch die Stellung der Aperturblende beeinflusst werden. Im Unterschied zu herkömmlichen Phasenkontrast können bei Relief-Phasenkontrast auch Objektive unterschiedlicher Hersteller an ein und demselben Mikroskop verwendet werden, ohne dass Fehljustierungen entstehen. Die vorbeschriebenen Effekte konnten durch Veränderungen des beleuchtenden Strahlenganges technisch realisiert werden. Alle weiteren Details hierzu werden in separaten Beiträgen beschrieben (www.relief-phasenkontrast.de bzw. www.relief-phase-contrast.com).
Native Epithelzellen, aufgenommen mit einem achomatischen Standard-Objektiv 40x, Weißlicht,
Teilansicht nativer Epithelzellen, aufgenommen mit höher korrigiertem Planapochromat 40x, Elektronenblitzbeleuchtung, Relief-Phasenkontrast (links) Interferenzkontrast (rechts)
Piper, J.: Relief-Phasenkontrast - eine universell einsetzbare Modifikation des Phasenkontrasts mit verbesserter Bildqualität - Piper, J.: Relief-phase-contrast - a new technique for phase-contrast light microscopy- Copyright: Joerg Piper, Bad Bertrich, Germany, 2010 |
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